238-239

Молекулярная генетика

Репликация

А. Механизм действия ДНК-полимеразы

Для передачи дочерним клеткам генетической информации в процессе репликации ДНК (DNA) должна быть создана копия генома. Репликация ДНК осуществляется ДНК-зависимыми ДНК-полимеразами. Эти ферменты используют в качестве шаблона одну из цепей двойной спирали ДНК, так называемую матрицу. На матрице, начиная с короткой стартовой последовательности (праймера), ферменты синтезируют комплементарную цепь и воспроизводят в итоге исходную двухтяжевую ДНК. Субстратами ДНК-полимераз являются четыре дезоксирибонуклеотидтрифосфата: аденозин-, гуанозин-, тимидин- и цитозинтрифосфаты. При каждом шаге синтеза ДНК происходит спаривание нуклеотида с соответствующим азотистым основанием матричной цепи. Затем α-фосфатная группа связанного нуклеотида подвергается нуклеофильной атаке со стороны 3'-ОН-группы предыдущего нуклеотида. За этим следует удаление дифосфата и образование новой фосфодиэфирной связи. Эти этапы повторяются снова и снова по мере движения ДНК-полимеразы от одного основания к следующему вдоль матрицы. В соответствии с этим механизмом матричная цепь ДНК считывается в направлении 3'→5'.

В большинстве клеток имеется несколько ДНК-полимераз. Наряду с ферментами, которые осуществляют собственно репликацию, существуют полимеразы, которые включены в процессы репарации ДНК (см. с. 252) или реплицируют митохондриальную ДНК эукариот. Большинство ДНК-полимераз построены из множества субъединиц, роль которых до конца не выяснена.

Б. Репликация в Е. coli

В настоящее время процесс репликации у прокариот достаточно изучен, в то время как многие аспекты эукариотической репликации остаются неясными. Однако с большой долей вероятности можно утверждать, что в большинстве клеток этот процесс протекает в основном одинаково. На схеме показана простейшая схема репликации у бактерии Escherichia coli. В бактериях репликация начинается со специфической точки в кольцевой ДНК (область начала репликации) и продолжается в обоих направлениях. В результате образуются две репликативные вилки, которые продвигаются в противоположных направлениях, т. е. обе цепи реплицируются одновременно. На схеме исходная ДНК (1) окрашена в голубой и фиолетовый цвета, а вновь синтезирующаяся - в розовый и оранжевый. В функционировании каждой вилки принимают участие множество различных белков, из которых здесь указаны наиболее важные.

Каждая репликативная вилка (2) включает по крайней мере две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы, которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи. Поскольку матричная цепь всегда читается в направлении 3'→5' (см. выше), только одна из цепей может считываться непрерывно (розовая/фиолетовая; 2). Другая цепь (голубого цвета) считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. В результате на матрице вначале синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК (зеленый/оранжевый), так называемые фрагменты Оказаки (OF), названные так по имени их первооткрывателя. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки (праймера, зеленого цвета), необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. Праймер синтезируется специальной РНК-полимеразой ('праймаза', на схеме не показана), ДНК-полимераза III достраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев (оранжевого цвета). Синтез этого фрагмента далее прерывается, и новый синтез начинается со следующего РНК-праймера. Индивидуальные фрагменты Оказаки первоначально не связаны друг с другом и все еще имеют РНК на 5'-концах (3). На некотором расстоянии от репликативной вилки ДНК-полимераза I начинает замещать РНК-праймер последовательностью ДНК. В завершение остающиеся одноцепочечные разрывы репарируются ДНК-лигазой. В образованной таким образом двойной спирали ДНК только одна из цепей синтезирована заново. Поэтому говорят, что репликация ДНК происходит по полуконсервативному механизму.