Молекулярная генетика. Генная инженерия
Клонирование ДНК
Развитие молекулярной генетики с 70-х
гг. в значительной степени основано на разработке и совершенствовании методов
анализа и манипулирования ДНК. Так называемая 'генная (генетическая)
инженерия' имеет практические приложения во многих областях. Например, были
разработаны новые методы диагностики и лечения заболеваний и стало возможным
проводить направленные изменения определенных свойств организма. Поскольку
полностью исключить биологический риск невозможно, при использовании методов
генной инженерии необходим осторожный подход. В этом и последующих разделах дан
краткий обзор методов, используемых в генной инженерии.
А. Эндонуклеазы
рестрикции
Большинство методик в генной инженерии
включают выделение определенных фрагментов ДНК (DNA) и последующее их соединение
с другими фрагментами для получения новых комбинаций генов. Для этих целей
используются ферменты, которые специфически разрезают и вновь сшивают молекулы
ДНК. Наиболее важной группой ферментов являются эндонуклеазы рестрикции
(рестриктазы), катализирующие специфическое расщепление двунитевой ДНК.
Известно большое число рестриктаз. Для их обозначения используются сокращенные
названия микроорганизмов - продуцентов. В качестве примера рассмотрим
EcoRI - эндонуклеазу, выделенную из Escherichia coli. Подобно
многим другим рестриктазам, этот фермент расщепляет ДНК по палиндромной
последовательности, т. е. короткому сегменту ДНК, в котором обе цепи при
считывании в направлении 5'→3' имеют одинаковую последовательность. Для
EcoRl это последовательность 5'-GAATTC-3'. Гомодимер EcoRI
расщепляет фосфодиэфирные связи обеих цепей между G и А. Это приводит к
образованию комплементарных 'липких' концов (ААТТ), которые удерживаются
вместе за счет спаривания оснований. Их, однако, можно легко отделить друг от
друга путем небольшого нагревания. При охлаждении липкие концы гибридизуются
вновь в правильной ориентации. Места расщепления можно соединить с помощью
ДНК-лигазы.
Б. Клонирование
ДНК
Обычно содержание в клетке какого-либо
сегмента ДНК, например отдельного гена, очень незначительно. Поэтому для
проведения экспериментов с фрагментами ДНК их необходимо многократно копировать
(клонировать). В классической методике клонирования ДНК используется
способность клеток бактерий поглощать и реплицировать короткие кольцевые
молекулы ДНК, известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК
вырезается из исходной ДНК с помощью рестриктазы (см. выше). Для демонстрации
метода на схеме показано расщепление с помощью EcoRI. На практике обычно
используются два разных фермента. В качестве переносчика ('вектора')
служит плазмида с единственным участком, узнаваемым EcoRI. Кольцевая
плазмида линеаризуется с помощью EcoRI и затем смешивается с изучаемым
фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют одинаковые липкие концы,
некоторые из молекул будут гибридизоваться таким образом, что клонируемый
фрагмент окажется интегрированным в структуру вектора. Затем концы линейной
молекулы ковалентно сшиваются с помощью ДНК-лигазы с образовании новой
('рекомбинантной") плазмиды. При обработке большого количества клеток
некоторые из них поглощают рекомбинантную плазмиду (так называемая
трансформация). Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с
собственным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформированной
клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибиотику. При
инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут реплицироваться
только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полученного клона выделяют
плазмиду и после расщепления рестриктазой EcoRI получают множество копий
клонированного фрагмента ДНК.